Sujeitos
Os casos foram selecionados do Departamento de Biologia Reprodutiva, AIIMS entre 2002 e 2003, enquanto foram encaminhados por vários hospitais, incluindo o nosso, para análise de hormônios reprodutivos para infertilidade, irregularidade menstrual ou amenorréia secundária. Trinta e quatro mulheres com insuficiência ovariana prematura (POF) (vide / Tabela 1)para critérios diagnósticos) foram selecionados para o estudo de 214 mulheres encaminhadas. Os casos suspeitos de POF foram entrevistados em detalhes para história médica, cirúrgica e de tratamento (particularmente estrogênio exógeno e quimioterapia citotóxica) e examinados clinicamente (geral e sistêmica) para excluir qualquer doença subjacente bruta [Tabela / fig 1] conforme proforma. A maioria dos casos foi investigada extensivamente fora (incluindo ultrassonografia, hormônios reprodutivos, hemograma, bioquímica, TSH, ANA, etc) antes de participar do nosso departamento. Todas as informações relacionadas foram obtidas em detalhes. Os casos foram selecionados de acordo com os critérios apresentados na (Tabela / Fig. 1) .
Ninguém tinha história de doença autoimune, remoção cirúrgica de gônadas, radioterapia ou quimioterapia. Todos os casos foram acompanhados por pelo menos um ano. Cinco mulheres conhecidas ciclicamente férteis (grupo C) e oito mulheres na menopausa (grupo B) foram incluídas para comparação. A coleta de sangue das mulheres férteis normalmente em ciclo foi coletada no dia 2 ou 3 do ciclo menstrual. Mulheres na pós-menopausa foram selecionadas de outro projeto em andamento do departamento. Nenhum dos casos teve ingestão exógena de estrogênio por 3 meses antes da coleta de sangue, embora a maioria tenha sido tratada com estrogênio no passado (mais de 3 meses atrás). O consentimento informado foi obtido antes da coleta de sangue. Todas as amostras de sangue estavam em estado de jejum. O soro foi isolado após centrifugação e armazenado a -80 ° C durante 1 a 10 meses antes do ensaio com inibina B e FSH.
Ensaios
A concentração sérica de FSH foi medida usando imunoensaio enzimático de micropartículas altamente específico (MEIA) usando o sistema de imunoensaio automatizado AxSYM (Abbott Laboratories, EUA). Os
coeficientes de variação inter e intra- ensaio foram <3%, a reatividade cruzada com TSH, LH e hCG foi <1% e o limite de detecção <0,4 mUI / ml. A concentração sérica de Inibina B foi medida utilizando um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima em sanduíche em fase sólida comercialmente disponível (ELISA) específico para a inibina dimérica B (Oxford Bio-Innovation Ltd. Oxford, Reino Unido via Serotec) (15) , (16). O primeiro anticorpo dirigido para a subunidade? B e o segundo anticorpo para a subunidade? E conjugado com fosfatase alcalina. O ensaio teve uma reactividade cruzada de 0,1% com activina e cerca de 1% com inibina A. O limite de sensibilidade / detecção do ensaio foi de 15 pg / ml e os coeficientes de variação inter / intra-placa foram <7%. Antes do ELISA, as amostras foram pré-tratadas com treino com detergente (SDS), aquecidas a 100ºC e expostas ao peróxido de hidrogênio para aumentar a sensibilidade e a especificidade. Controle e padrão conhecido (1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 e 15,6) foram utilizados para o estudo. Pacientes com concentração de inibina B abaixo do limite de detecção, ou seja, 15 pg foram atribuídos como indetectáveis. Todas as amostras foram testadas em duplicado.
Placas de microtitulação foram pré-revestidas com um anticorpo monoclonal para a subunidade beta-B da inibina. Amostras (incluindo controle e padrão) foram incubadas nos poços para que o antígeno se ligasse ao anticorpo imobilizado por meio de sua subunidade βB. Após a lavagem, foi adicionado um anticorpo de detecção. Este foi um anticorpo monoclonal específico para a subunidade α da inibina acoplada à fosfatase alcalina. Qualquer material que não reagiu é então removido por lavagem antes da detecção da fosfatase alcalina utilizando um substrato amplificado sensível. Isso resultou em um produto de reação vermelho com intensidade de cor proporcional à concentração de inibina dimérica B presente em <