Coleção de ovócitos GV
Os ovócitos foram obtidos de camundongos fêmeas da linhagem ICR com 3-4 semanas de idade, os animais foram mantidos sob condições controladas (14h de luz: 10h de escuro) e alimentados com água e pellets ab libitum. Os ratinhos foram estimulados por uma injecção ip de 7.5 IU de gonadotrofina sérica de égua gestante (PMSG). 46 horas depois, os animais foram mortos por deslocamento cervical e os ovários foram removidos em meio líquido tubário humano (HTF) tamponado com Hepes (sigma) suplementado com 5 mg / ml de BSA. Os ovócitos do estágio GV de folículos antrais ovarianos foram liberados por punção com uma agulha de microinjecção 28G sob um estereomicroscópio. Os "complexos de ovócitos cumulus GV" foram alocados aleatoriamente em três grupos: controle sem tratamento, preservação gradual e grupo de vitrificação de etapa única.
Preparação de soluções de vitrificação e descongelamento
As soluções para vitrificação e diluição foram preparadas usando PB1 mais 20% de soro bovino fetal. A solução de vitrificação progressiva consistia em solução A, que era composta por 10% (v / v) de etilenoglicol, 4,5% (W / V) de Ficoll-70 e 0,075 M de sacarose, e solução B que era composta por 20% (V / V) etilenoglicol, 9,0% (p / v) de Ficoll-70 e 0,15 M de sacarose e soluo C, que foi composta por 30% (v / v) de etilenoglicol, 18% (p / v) de Ficoll-70 e 0,3 M de sacarose. A solução de vitrificação de etapa única consistia apenas em 30% (V / V) de etilenoglicol, 18% (W / V) de Ficoll-70 e 0,3 M de sacarose. As soluções para descongelação foram feitas com 0,5, 0,25 e 0,125 M de sacarose.
Vitrificação e Descongelamento
Os GV-COC foram aleatoriamente divididos em grupos stepwise ou single step. No grupo stepwise, os ovócitos da fase GV foram expostos primeiro por 5 min a 200 ml de gotículas da solução A, depois por 2 min a 200μl da solução B e finalmente por 1 min a 200μl da solução C em Placas de 4 poços. No grupo de etapa única, os ovócitos do estágio GV foram expostos por 1 min a 200µl da solução C.
Os procedimentos foram realizados em temperatura ambiente de 22 a 24ºC. Depois de obter o equilíbrio, 10-15 ovócitos GV foram carregados em um canudo de plástico de 0,25 ml (IVM, I Aigle, França). A palha foi preenchida com 1 cm de meio de vitrificação, 0,5 cm de ar, 2 cm de meio de Vitrificação contendo oócitos, 0,5 cm de ar e 3,5 cm de meio de vitrificação. A palha foi selada a quente e mergulhada em nitrogênio líquido. Após armazenamento por 1-5 dias, a palha foi retirada do nitrogênio líquido, mantida em ar por 10 s, e depois mergulhada em água a 37ºC por 10 s. A palha foi então removida da água e seca. Foi cortado com tesoura e os conteúdos contendo oócitos foram expelidos em gotas de 400 ul com uma série sequencial de 0,5, 0,25 e 0,125 M de sacarose mantendo-se por 90 s em cada solução, e lavados por 6 min em meio α-MEM suplementado com 20% de FBS.
Maturação de
ovócitos GV Os oócitos VG descongelado vitrificados ou ovócitos GV frescos (grupo controle) foram cultivados em 100 ul de meio IVM composto de α-MEM suplementado com piruvato de sódio 0,23 mM, 1 mg / ml de fetuína, antibiótico e solução antimicótica (compreendendo 100 U de penicilina, 100 μg de estreptomicina e 0,25 μg de anfotericina B), 10 ng / ml de fator de crescimento epitelial de rato de grau de cultura (EGF, Upstate Biotechnology Inc., Lake placid, NY), 75 mU / ml de hormônio folículo-estimulante (fertinome, serono, Genebra, Suíça) e 3 mg / ml de albumina sérica bovina (BSA, Fraction V, Sigma) sob óleo mineral de grau testado em embrião (sigma) e incubados a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 no ar umidificado. 16-18 h após a cultura, os oócitos GV-COC com o primeiro corpo polar foram definidos como oócitos maduros MII.
Fertilização e Desenvolvimento In Vitro
Os espermatozóides de ratinhos ICR machos com 12 semanas de idade foram libertados por punção da cauda do Epididymis em meio TYH meio FIV suplementado com 4 mg / ml de BSA. Os espermatozóides foram suspensos em 200 μl de meio FIV, cobertos com óleo mineral e incubados a 37ºC por 1-2 horas em atmosfera úmida de 5% de CO2 para capacitação. Os oócitos maduros durante o treino (n = 15-20) foram colocados em gotas separadas de 200 µl de Meio FIV sob óleo mineral. Mistura de espermatozóides (10-20 mL) foi adicionado a cada gotícula para obter uma concentração de 1-2 × 106 espermatozóides móveis / ml. Após co-incubação por 5 h a 37ºC, os oócitos foram removidos e lavados em meio TYH fresco e colocados em incubadora de CO2 a 5% a 37ºC. Às 6-8 h pós-inseminação, os embriões com dois pronúcleos distintos e um segundo corpo polar foram classificados como PN estágio, observado sob um microscópio invertido de contraste de fase.
Análise Estatística
Os dados coletados foram analisados pelo teste one-way ANOVA. A diferença nos valores de Sobrevivência, Maturação, Fertilização e Taxa de Desenvolvimento, foi considerada significativa quando o valor de p foi <0,05.