Amostra de urina :
Colheu-se uma amostra de urina a meio do fluxo num tubo de centruga de pltico de 50 ml. As células de urina foram lavadas três vezes em PBS, o tratamento hipotónico foi dado durante 20 minutos e o sedimento foi fixado usando 3 lavagens em fixador, como com lavagem na boca. Finalmente, as células foram ressuspensas em 50-100 µl de fixador fresco, dependendo do tamanho do sedimento celular.
Preparação de slides
Aproximadamente 10 ul de suspensão de células foram aplicadas em cada lâmina de vidro microscópica não revestida limpa. A lâmina foi então tratada com ácido acético a 70% durante 1 minuto (para células de sangue e urina) ou 2 minutos (células bucais) e desidratada em série de álcool (etanol a 70%, 90% e 100%) durante três minutos em cada. As células fixadas nas lâminas foram tratadas por 20 minutos a 37ºC em solução de pepsina (10 µg / ml, pH 1,5-2,0), lavadas em água, fixadas em paraformaldeído a 1% a 4ºC por dez minutos e finalmente desidratadas como antes.
Sondas FISH
A sonda específica para o locus cromossómico 21 foi comercialmente adquirida à Vysis Inc. (França), enquanto que as sondas alfafóides do cromossoma 1 e 18 foram obtidas da Uniba Biologia, Itália.
Preparação para sonda e FISH
Prepara�o da sonda, hibrida�o, lavagem e visualiza�o ap� hibrida�o foi de acordo com o protocolo Vysis (www.vysis.com). As sondas e o DNA celular foram desnaturados juntos por 3 minutos (para células de sangue e urina) ou 5 minutos (para células bucais) a 75ºC em estufa e incubados a 37ºC em câmara úmida por 12-18 horas (durante a noite). Durante o estudo, os spreads de metáfase de linfócitos foram utilizados para verificar a especificidade e eficiência da hibridização. A lavagem pós-hibridação foi feita de acordo com o protocolo Vysis usando NP40. As lâminas foram contra-coradas e montadas usando anti-degelo contendo DAPI antes da triagem sob um microscópio de fluorescência Nikon Optiphot / Olympus BX51. As imagens foram capturadas usando um sistema de imagem digital (Applied Imaging, UK). N
Resultados
A eficiência de hibridização baseada na avaliação da metafase das sondas foi de 100% e não ocorreu hibridação cruzada. A eficiência de hibridação da interfase de sondas em todos os tipos de células foi superior a 90%. Aproximadamente algumas centenas de núcleos cada de sangue (857), bucal (1002) e células de urina (397) foram pontuados de três casos de trissomia 21 com a sonda específica do locus do cromossoma 21. O número esperado de sinais foi obtido em 91%, 89,8% e 87,4% de núcleos com células de sangue, urina e bucais, respectivamente (Tabela / Figura 5) , (Tabela / Figura 6) , (Tabela / Figura 7) . Este resultado foi comparável com os cromossoma 1 e 18 sondas de alfoides (Tabela / Fig. 8) . Figuras mostram sinais obtidos com sangue [Tabela / Fig 1], [Tabela / Fig 2], bucal (Tabela / Fig 3) e amostras de urina [Tabela / Fig. 4] com a sonda específica do locus do cromossoma 21 das mulheres.
Discussão
A intenção deste estudo foi determinar se as células sanguíneas, bucais e urinárias poderiam ser usadas para diagnóstico específico para facilitar o manejo dos pacientes. Este estudo indica que FISH interfase com sondas específicas locus pode ser usado com sucesso nestas preparações. A técnica é simples, não invasiva e rápida, proporcionando resultados em poucas horas (sonda alpóide) a 24 horas. As células estão facilmente disponíveis e podem ser coletadas sem trauma por técnicas não invasivas / minimamente invasivas. Como o procedimento foi rápido, pode ser de extrema ajuda em situações como genitália ambígua, onde a atribuição de sexo é necessária em poucas horas por razões sociais, bem como para o manejo adequado (4) , (6). Tem valor similar em um bebê agudamente doente com malformações sugestivas de trissomia 21/18/13 / etc (4) ou microdeleções (DiGeorge, Velo Cardio Facial, etc) (7) que requerem operação urgente / cuidados intensivos.